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如果醫(yī)生想深入了解腫瘤，他們的選擇很有限。他們可以掃描相關(guān)區(qū)域、采集組織活檢，或監(jiān)控血液的標(biāo)志物，如PSA或CA 125。不過，這些都不太理想：成像的分辨率不高，活檢是侵入性的，而良好的標(biāo)志物是少之又少。

   最理想的情況是，研究人員能通過簡單的血液檢測來實(shí)現(xiàn)組織活檢的敏感性和特異性。如今，液體活檢的出現(xiàn)，讓這一切成為可能。

   液體活檢

   據(jù)斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的助理教授Max Diehn介紹，就傳統(tǒng)的癌癥標(biāo)志物而言，普遍的問題是特異性。“對于之前探索的大多數(shù)生物標(biāo)志物，正常細(xì)胞也會產(chǎn)生，因此并不是腫瘤細(xì)胞所獨(dú)有的。這意味著，它們往往不是很特異。”液體活檢則通過搜索血液及其他體液中更加特異的腫瘤指紋，來克服這方面的缺陷。

   這些指紋有兩種形式：循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）是從腫瘤上脫落的活細(xì)胞，可能代表了轉(zhuǎn)移的種子；循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）則是來自死細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，通常以DNA短片段的形式存在。Diehn實(shí)驗(yàn)室最近介紹了一種檢測非小細(xì)胞肺癌患者血液中的ctDNA的方法，這些片段的平均長度為170 bp 。

  當(dāng)然，正常細(xì)胞也存在于血液中，而且每天都有正常細(xì)胞死亡。因此，無論研究人員是尋找CTC還是ctDNA，他們都必須慧眼識珠。對于CTC，這通常是借助細(xì)胞表型來實(shí)現(xiàn)的，如利用Janssen Diagnostics的CELLSEARCH分析，它根據(jù)上皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)來選擇細(xì)胞。

   對于ctDNA，研究人員必須根據(jù)它們的序列來挑出片段，這是個(gè)艱巨的任務(wù)，因?yàn)闆]突變的DNA不能提供信息。因此，這項(xiàng)技術(shù)適用于突變已知的情況。例如，Diehn開始鑒定NSCLC患者中常常突變的基因組區(qū)域，生成CAPP-Seq selector文庫。這個(gè)寡核苷酸集合代表了139個(gè)基因的521個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子。研究小組利用它來收集血漿中的互補(bǔ)DNA片段，并以高覆蓋度測序。

   根據(jù)2014年約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究，ctDNA可在各類腫瘤患者的血漿或血清中發(fā)現(xiàn)，不過隨著腫瘤位置和分期的不同，分析的敏感性也有差異。“75%的晚期胰腺癌、卵巢癌、大腸癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌等癌癥患者中可檢測到ctDNA，不過對于原發(fā)性腦癌、腎癌、前列腺癌或甲狀腺癌，檢測率不到50%，”作者寫道。

   約翰霍普金斯大學(xué)的腫瘤學(xué)教授Nickolas Papadopoulos表示，研究人員可以通過靠近源頭來實(shí)現(xiàn)更高的敏感性，比如，在檢查泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤時(shí)檢測尿液，或在檢查頭頸部癌癥時(shí)檢測唾液。實(shí)際上，研究小組最近發(fā)現(xiàn)通過腦脊液檢查，使得中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤檢測有所改善。

   如同許多ctDNA研究一樣，霍普金斯的團(tuán)隊(duì)也使用靶向測序來檢測ctDNA。在這種情況下，一種稱為Safe-SeqS的條形碼策略可準(zhǔn)確報(bào)告樣本中的ctDNA分子數(shù)量。研究人員也可以利用數(shù)字PCR來定量具體的變化，不過有的作者指出，“數(shù)字PCR分析提供了高的準(zhǔn)確性和靈敏度，但需要個(gè)性化分析的設(shè)計(jì)，這是限速步驟”。

   有利有弊

   研究人員檢測癌癥患者的血液及其他體液中的ctDNA，使其成為一種有潛力的生物標(biāo)志物。然而，據(jù)Papadopoulos介紹，ctDNA不僅僅是指標(biāo)，似乎還與“腫瘤負(fù)荷”有關(guān)，其水平隨疾病嚴(yán)重程度而升高。此外，一些早期的癌癥也能檢測到ctDNA，表明不僅可使用ctDNA來監(jiān)控現(xiàn)有的癌癥，還能作為篩查工具。

   美國國家癌癥研究所淋巴治療科的科長Wyndham Wilson表示，ctDNA還能用于預(yù)測腫瘤的復(fù)發(fā)。在一項(xiàng)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的研究中5，ctDNA能夠在CT掃描前幾個(gè)月就發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)。因此，醫(yī)生能夠更早治療患者，改善他們的長期預(yù)后。

   然而，ctDNA作為篩查工具，也面臨一些潛在的問題。目前還不清楚ctDNA在不同的癌癥類型、分期和患者中的普遍程度。即使檢測到ctDNA，也不清楚是體內(nèi)哪里產(chǎn)生的，或者即使檢測到的突變與腫瘤存在一定關(guān)聯(lián)，也需要后續(xù)檢測。

   相比之下，CTC分析能提供基因組完整的活細(xì)胞。因此，研究人員可分離出這些細(xì)胞，在顯微鏡下觀察它們，并研究每個(gè)細(xì)胞的基因組和蛋白表達(dá)。Aviva Biosciences公司的研發(fā)副總裁Antonio Guia認(rèn)為，這帶來了比ctDNA分析更廣譜的方法，因此你不必看特定基因的特定片段。

   最近，哈佛大學(xué)的Daniel Haber及其同事就開展了一些研究，利用單細(xì)胞RNA-Seq來鑒定單個(gè)前列腺癌CTC的信號差異，并將這些差異與治療反應(yīng)相關(guān)聯(lián)6。研究小組利用一種稱為CTC-iChip的微流體設(shè)備來分離CTC，它根據(jù)CD45或CD66的表達(dá)將CTC與其他血細(xì)胞分離。

   不過，對于液體活檢而言，問題并不在于選擇CTC還是ctDNA。Janssen Diagnostics的首席醫(yī)療官Jorge Villacian認(rèn)為，兩種標(biāo)志物能提供互補(bǔ)的信息，作為臨床工具都有市場。這家公司專注于CTC診斷。

   “腫瘤醫(yī)生以及監(jiān)管部門對液體活檢的概念了解得越多，對每個(gè)人都是雙贏的 – 對患者、對醫(yī)生以及對制度本身，因?yàn)檫@將使得發(fā)病率更低、并發(fā)癥更少，并改變早期治療，對患者有利。”

   小知識：ctDNA是什么

   癌細(xì)胞在破裂和死亡時(shí)，會釋放出循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）等內(nèi)容物，這種ctDNA是飄浮在血液中的基因組片段。細(xì)胞殘骸一般由清道夫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞）清除，然而腫瘤很大細(xì)胞增殖又很快，導(dǎo)至清道夫細(xì)胞應(yīng)付不過來。

   對血液中的腫瘤DNA進(jìn)行檢測和測序，可以幫助人們通過取血得到更全面的癌癥信息，告訴醫(yī)生治療是否已經(jīng)起作用，腫瘤有沒有演化出抗性。

   當(dāng)然這一技術(shù)的應(yīng)用也面臨著一些問題。舉例來說，不同人的ctDNA水平差異較大，而且ctDNA并不那么容易檢測，特別是在腫瘤的早期階段。另外，人們還需要在更大型的研究中進(jìn)行驗(yàn)證，看ctDNA是否給出了足夠準(zhǔn)確的信息。

   如果能夠克服上述障礙，醫(yī)生們將能根據(jù)ctDNA進(jìn)行更好的治療，隨著癌癥的演化調(diào)整治療策略，Johns Hopkins大學(xué)的Victor Velculescu說。“這種技術(shù)可以幫助人們最終實(shí)現(xiàn)個(gè)性化醫(yī)療，為癌癥領(lǐng)域帶來一場新的變革。”

   ctDNA發(fā)展簡史

   1948年科學(xué)家們首次發(fā)現(xiàn)人體血液中存在著循環(huán)DNA，癌癥患者的循環(huán)DNA則發(fā)現(xiàn)于1977年。在那之后又過了17年，人們才發(fā)現(xiàn)這些DNA含有癌癥的標(biāo)志性突變，說明它們來自于腫瘤。

   最開始，循環(huán)DNA的實(shí)際應(yīng)用并不在癌癥領(lǐng)域。鑒于腫瘤DNA會流入血液，香港中文大學(xué)的盧煜明（Dennis Lo）教授推測胎兒DNA應(yīng)該也能進(jìn)入血液。1997年他向人們成功展示，孕婦血液中攜帶著男性胎兒的Y染色體。這一發(fā)現(xiàn)允許醫(yī)生們在懷孕初期通過無創(chuàng)方式檢測胎兒的性別，甚至篩查唐氏綜合癥等發(fā)育疾病。這是產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的一次革命。

   “癌癥研究后來才跟上進(jìn)度，”英國癌癥研究所Nitzan Rosenfeld說。這是因?yàn)槟[瘤DNA比胎兒DNA更難檢測，而且早期的測序技術(shù)還不夠準(zhǔn)確可靠。

   近十年來隨著技術(shù)的進(jìn)步，DNA檢測技術(shù)已經(jīng)足夠靈敏。舉例來說，BEAMing擴(kuò)增法可將循環(huán)DNA連在磁珠上，然后進(jìn)行分離和計(jì)數(shù)。即使健康細(xì)胞DNA與ctDNA的比值達(dá)到10,000：1，BEAMing擴(kuò)增法也可以有效檢測出ctDNA來。

   BEAMing擴(kuò)增法是JohnsHopkins大學(xué)的Bert Vogelstein和Kenneth Kinzler開發(fā)的。2007年，他們用這一技術(shù)對18名腸癌患者的ctDNA進(jìn)行了跟蹤。手術(shù)后這些患者的ctDNA水平下降了99%，其中許多患者的ctDNA并沒有完全消失。研究顯示，手術(shù)后仍檢測得到ctDNA的患者，基本上都出現(xiàn)了癌癥復(fù)發(fā)。但手術(shù)后沒有檢測到ctDNA的患者，腸癌并沒有復(fù)發(fā)。

   這說明ctDNA能夠展現(xiàn)患者對手術(shù)的應(yīng)答情況，告知醫(yī)生他們是否需要進(jìn)行化療。研究者們很快也在其他癌癥類型中得到了類似的結(jié)果。Rosenfel等人發(fā)現(xiàn)，ctDNA能夠提供晚期卵巢癌和乳腺癌的準(zhǔn)確信息。而Diaz等人在至少75%的晚期腫瘤患者中檢測了ctDNA，涉及了多種器官，比如胰腺、膀胱、皮膚、胃、食道、肝臟和頭頸。（腦癌除外，因?yàn)檠X屏障使腫瘤DNA無法進(jìn)入血液。）

   ctDNA有何優(yōu)勢

   循環(huán)DNA將比人們幾十年來鑒定的蛋白指標(biāo)更加好用，因?yàn)閏tDNA檢測很少有假陽性。此外，ctDNA半衰期只有不到兩小時(shí)，而絕大多數(shù)蛋白指標(biāo)能在血液中存在幾個(gè)星期，可見ctDNA能更清晰的反映腫瘤的當(dāng)前信息。有研究表明，在檢測乳腺癌和腸癌時(shí)，ctDNA比蛋白質(zhì)指標(biāo)更靈敏，還可以跟蹤腫瘤的消失、擴(kuò)散和復(fù)發(fā)。

   血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞也是癌癥研究的一大熱點(diǎn)。不過，ctDNA比循環(huán)腫瘤細(xì)胞還要靈敏，數(shù)量也更多，更適合成為癌癥的生物學(xué)指標(biāo)。

   ctDNA的最大優(yōu)勢在于，能夠?qū)δ[瘤的演化和適應(yīng)性改變進(jìn)行監(jiān)控。這樣的研究可以回答許多困擾科學(xué)家多年的問題，比如，為何那么多靶向性治療都以失敗告終，癌癥是怎樣發(fā)展出抗性的等等。

   EGFR在細(xì)胞生長和分裂中起到了重要的作用，在癌細(xì)胞中特別活躍。Gefitinib和panitumumab是阻斷EGFR的抗癌藥物，這些藥物起初都能有效治療患者。但幾個(gè)月后，癌癥就會通過其他基因突變（例如KRAS）對它們產(chǎn)生抗性。

   要監(jiān)控患者的癌癥發(fā)展，醫(yī)生們目前得進(jìn)行多次活檢，以決定下一步的治療策略。然而癌癥晚期患者通常有好幾個(gè)需要檢測的腫瘤，單個(gè)腫瘤中也可能存在不同的抵抗機(jī)制。更重要的是，活檢有一定的風(fēng)險(xiǎn)性，難以用于肺部等脆弱的器官。相比之下，血檢就容易多了。

   2012年，Diaz研究團(tuán)隊(duì)對接受EGFR抑制劑治療的患者進(jìn)行ctDNA分析。他們發(fā)現(xiàn)了42種與癌癥抗性有關(guān)的KRAS突變，利用這些突變可以比傳統(tǒng)方法早五個(gè)月發(fā)現(xiàn)腫瘤的變化。Rosenfeld團(tuán)隊(duì)則收集了六名晚期乳腺癌、肺癌和卵巢癌患者的血樣，并且進(jìn)行了完整的外顯子組測序。他們由此揭示了癌癥抗性的發(fā)展路徑，例如癌細(xì)胞出現(xiàn)突變，阻止藥物與其目標(biāo)結(jié)合。

   如果醫(yī)生們能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)癌癥的抗性，就可以早點(diǎn)停用已經(jīng)不起作用的昂貴藥物。研究癌癥抗性背后的突變，還有助于開發(fā)更有效的癌癥療法或者藥物組合。“我們的目標(biāo)是將癌癥從一種致命疾病轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N慢性病，” Velculescu說。“當(dāng)治療不起作用時(shí)，可以換用其他的治療途徑。”

   科學(xué)家們逐漸發(fā)現(xiàn)，腫瘤有著很高的異質(zhì)性，標(biāo)準(zhǔn)程序（tissue biopsy）根本不足以判斷癌癥的預(yù)后情況。而且活檢得到的是靜態(tài)信息，無法準(zhǔn)確反映癌癥的演化。在這種情況下，ctDNA就成為了科學(xué)家們的新希望，它能為人們揭示更多的癌癥信息，甚至跟蹤癌癥的發(fā)展。

   如果能夠得到充分利用，血液循環(huán)中的腫瘤DNA將為癌癥治療帶來一場變革。

   理想與現(xiàn)實(shí)

   潛力巨大，但目前ctDNA還無法成為臨床上的主要診療手段。這是因?yàn)?，最靈敏的ctDNA檢測（例如BEAMing）需要事先知道想要檢測的突變，但獲得這樣的信息又相當(dāng)麻煩。外顯子組測序不需要預(yù)先知道任何信息，但檢測罕見突變的需求深度測序，這樣做的成本非常高。

   斯坦福大學(xué)的MaximilianDiehn決定將上述兩種方法的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來。他的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，基因組有一小部分（僅0.004%）在肺癌中反復(fù)突變。在獲得患者血樣之后，對這一部分進(jìn)行深度測序，能夠以低廉的成本檢測罕見突變。目前，該團(tuán)隊(duì)正在嘗試將類似技術(shù)用于其他類型的癌癥，并在臨床試驗(yàn)中加以驗(yàn)證。

   幾乎所有的活檢技術(shù)，都不能很好的檢測早期癌癥。ctDNA在一項(xiàng)研究中檢測出了所有II級以上的肺癌，但只檢測出了一半的I級腫瘤，這多半是因?yàn)橥砥诎┌Y能釋放出更多的DNA。這個(gè)問題無意會限制ctDNA在癌癥篩查中的應(yīng)用。

   在ctDNA走入臨床之前，還有一些其他的問題有待解決。例如，ctDNA是否能真實(shí)反映癌癥的特征？轉(zhuǎn)移瘤是否和原發(fā)瘤釋放同樣多的DNA？Diaz指出，人們需要在患者死后快速對所有腫瘤取樣，將其與患者生前的ctDNA進(jìn)行比較。“這將是一項(xiàng)艱巨任務(wù)，”他說。

   ctDNA提供的信息是否真的能夠挽救患者生命或者提高他們的生活質(zhì)量呢？“光監(jiān)控腫瘤是不夠的，”Johns Hopkins大學(xué)的腫瘤學(xué)家Luis Diaz說。“實(shí)際應(yīng)用才是我們面臨的真正挑戰(zhàn)。”

   目前，癌癥的靶向性治療還遠(yuǎn)遠(yuǎn)跟不上科學(xué)家們的癌癥研究。如何將研究成果轉(zhuǎn)化為醫(yī)療進(jìn)步，這也是ctDNA研究中最現(xiàn)實(shí)的一個(gè)問題。

   ctDNA可能一時(shí)半會兒還無法決定癌癥的治療，不過它仍不失為一個(gè)寶貴的研究工具。越來越多的醫(yī)生正在把ctDNA采集列入自己的常規(guī)操作中。

   小知識：CTC

   1.循環(huán)腫瘤分子特征分析

   英國癌癥中心發(fā)表在NatureReviews上的綜述，全面的介紹了CTC經(jīng)歷EMT機(jī)制入血到形成轉(zhuǎn)移灶的過程中CTC的分子特征的的變化。Matthew G. Krebs指出：CTC分析技術(shù)可以用于評估腫瘤異質(zhì)性和疾病進(jìn)程，在治療過程中，身體中占支配地位的CTC是不斷變化的，伴隨治療耐藥的出現(xiàn)，耐藥性CTC逐漸在治療后增多。CTC的分析可以通過動態(tài)監(jiān)測腫瘤細(xì)胞的變化，實(shí)時(shí)、動態(tài)的反映患者的治療狀況及疾病進(jìn)程，為目前的腫瘤治療監(jiān)測提供很好的補(bǔ)充。

   2.CTC培養(yǎng)用于藥物敏感性試驗(yàn)

   哈佛醫(yī)學(xué)院的研究人員發(fā)表在science上發(fā)表的一項(xiàng)研究，研究通過體外培養(yǎng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞，并將其用于基因測序和藥物敏感試驗(yàn)。

   哈佛醫(yī)學(xué)院的Daniel Haber從36個(gè)患者樣本中分離出了CTC細(xì)胞，并通過體外培養(yǎng)建立了細(xì)胞系。這些細(xì)胞系完整的保留了原始的細(xì)胞形態(tài)和特征，動物試驗(yàn)顯示這5個(gè)CTC細(xì)胞系中有3個(gè)檢測到小鼠致瘤。

   研究人員藥物敏感性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CTC藥物敏感性測量結(jié)果與臨床病史一致，包括紫杉醇和卡培他濱的敏感性、氟維司群和阿霉素的耐藥性。隨著CTC培養(yǎng)條件的優(yōu)化，這個(gè)策略可以幫助惡性腫瘤患者在整個(gè)疾病過程中接受最好的治療。

   3.循環(huán)腫瘤胞團(tuán)

   由哈佛大學(xué)完成的一項(xiàng)關(guān)于循環(huán)腫瘤細(xì)胞團(tuán)的研究發(fā)表在cell，該項(xiàng)研究中研究人員通過示蹤標(biāo)記乳腺腫瘤的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)CTC細(xì)胞團(tuán)是由單克隆腫瘤細(xì)胞群形成而不是在血液循環(huán)中聚集形成。雖然血液中CTC細(xì)胞團(tuán)相對單個(gè)CTC而言較為稀少，但是其形成轉(zhuǎn)移的潛能是單個(gè)CTC的20~50倍。該項(xiàng)研究說明循環(huán)腫瘤細(xì)胞團(tuán)有更大的轉(zhuǎn)移潛能，是單個(gè)CTC轉(zhuǎn)移潛能的20~50倍。

   4.CTC表型和核型分析的臨床意義

   由北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院完成的一項(xiàng)關(guān)于循環(huán)腫瘤細(xì)胞表型和核型分析的研究發(fā)表在Oncotarget，研究人員通過陰性富集技術(shù)結(jié)熒光原位雜交技術(shù)檢測CTC，進(jìn)一步分析胃癌CTC中人表皮生長因子受體（HER2）表達(dá)及8號染色體非整倍體。

   該項(xiàng)研究結(jié)果顯示CTC水平的HER2檢測與靶向治療用藥相關(guān)，CTC核型分析表明8號染色體不同倍體對于紫杉醇、順鉑化療敏感或耐藥存在相關(guān)性。根據(jù)CTC 8號染色體核型或者HER2 表達(dá)可以監(jiān)測胃癌患者化療耐藥以及評估治療療效。

   文章來源于外泌體資訊網(wǎng) https://www.exosomemed.com/482.html