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作者：企鵝

干細(xì)胞有望治療多種疾病。正在進(jìn)行的700多項(xiàng)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）臨床試驗(yàn)中，包括治療自身免疫疾病和神經(jīng)退行性疾病。然而，使用MSCs的臨床前研究和臨床試驗(yàn)的效果不是太好，部分原因是對其作用機(jī)制（MOA）的理解有限。MSC領(lǐng)域中的一個特殊難題是在全身移植后，由于它們的尺寸大，MSC很快被滯留在肺血管系統(tǒng)中；通常小于1％的MSC能到達(dá)靶位點(diǎn)，但是經(jīng)常能觀察到治療效果。目前人們將MSC的治療功能主要?dú)w因于旁分泌效應(yīng)。研究人員推斷，體內(nèi)原位移植細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外囊泡（EVs）可能是干細(xì)胞促進(jìn)遠(yuǎn)端部位組織重塑和再生的機(jī)制。實(shí)際上，最近的幾項(xiàng)研究表明，EVs可以通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，MSC衍生的EVs具有治療功能。

為了解析移植干細(xì)胞的治療機(jī)制，并開發(fā)基于外泌體的納米治療劑治療自身免疫性疾病和神經(jīng)退行性疾病，來自加利福尼亞大學(xué)歐文分校的Weian Zhao教授在ACS Nano（影響因子13.709）發(fā)表文章，使用實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠模型評估了人間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）分泌的外泌體在治療多發(fā)性硬化癥中的作用。

MSC外泌體改善EAE小鼠的臨床評分和相關(guān)的神經(jīng)學(xué)參數(shù)。A）誘導(dǎo)EAE和治療（外泌體或MSCs）方法的示意圖，小鼠在第18天接受臨床評分直至第40天；B）PBS、天然MSC和IFNγ刺激的MSC及其外泌體注射后，EAE小鼠的臨床評分；C）使用兩種劑量外泌體進(jìn)行劑量研究，并將結(jié)果與PBS對照進(jìn)行比較；D）盧卡斯快藍(lán)染色的代表性脊髓切片，虛線表示白質(zhì)損壞區(qū)域；E）不同組中脫髓鞘區(qū)域的定量。

為了將EVs作為無細(xì)胞療法開發(fā)并闡明它們在干細(xì)胞體內(nèi)作用中的潛在機(jī)制，該研究評估了從MSCs釋放的外泌體（MSC-外泌體）治療破壞性自身免疫和神經(jīng)退行性疾病，特別是多發(fā)性硬化癥（MS）。MS是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的炎性疾病，其可導(dǎo)致脫髓鞘、神經(jīng)元損傷和喪失，并最終導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，目前是醫(yī)療保健系統(tǒng)的重大負(fù)擔(dān)。

研究發(fā)現(xiàn)靜脈注射由IFNγ刺激的MSCs產(chǎn)生的外泌體（IFNγ-Exo）（i）與PBS對照相比降低了EAE小鼠的平均臨床評分；（ii）脫髓鞘減少；（iii）神經(jīng)炎癥減少；（iv）上調(diào)EAE小鼠脊髓內(nèi)CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）的數(shù)量。

IFNγ-Exo與體外活化的外周血單核細(xì)胞（PBMCs）細(xì)胞的共培養(yǎng)降低了PBMC增殖和促炎性Th1和Th17細(xì)胞因子的水平，包括IL-6、IL-12p70、IL-17AF和IL-22，而免疫抑制細(xì)胞因子吲哚胺2,3-雙加氧酶水平升高。IFNγ-Exo還可以在小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中體外誘導(dǎo)Tregs，可能由第三方輔助細(xì)胞類型介導(dǎo)。

此外，通過深度RNA測序表明IFNγ-Exo含有抗炎RNAs，抑制這些RNAs可部分抑制外泌體誘導(dǎo)Tregs的潛力。此外，還發(fā)現(xiàn)IFNγ-Exo含有多種抗炎和神經(jīng)保護(hù)蛋白。這些結(jié)果不僅揭示了干細(xì)胞治療機(jī)制，而且提供了證據(jù)證明MSC外泌體作為無細(xì)胞療法用于治療自身免疫和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛力。

天然MSC，IFNγ-MSC及其外泌體的RNA全轉(zhuǎn)錄組深度測序分析。A）MSC及其外來體的蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄物（mRNA）和非編碼轉(zhuǎn)錄物；B）Native-Exo的全RNA序列概述；C）Native-Exo的非編碼RNA序列概述（不同類型的非編碼RNA的百分比）；D）IFNγ-Exo的全RNA序列概述；E）IFNγ-Exo的非編碼RNA序列概述（不同類型的非編碼RNA的百分比）。

MSCs和外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)。A）天然和IFNγ-MSC及其相應(yīng)的外泌體的蛋白質(zhì)組成的比較；B）Native-Exo和IFNγ-Exo的蛋白質(zhì)組成的比較；C）與Native-Exo相比， IFNγ-Exo富含HSP70和Gal-1。

總之，研究發(fā)現(xiàn)IFNγ-Exo的全身注射可產(chǎn)生持續(xù)的臨床恢復(fù)，同時使EAE小鼠的運(yùn)動技能改善，神經(jīng)炎癥減少和脫髓鞘減少。該研究有助于了解移植干細(xì)胞的治療機(jī)制，并提供基于無細(xì)胞外泌體的治療平臺，以治療MS或其他自身免疫和神經(jīng)退行性疾病。

MSC上清收集

將80％ confluent的細(xì)胞與15％去外泌體的FBS的完全培養(yǎng)基一起培養(yǎng)3天。為了去外泌體，將FBS以120,000×g離心18小時。但是，作者提醒不同的方案可能導(dǎo)致FBS外泌體去除的效率。

外泌體的分離

將MSC的條件培養(yǎng)基（有或沒有IFNγ處理）以300×g離心10分鐘以除去細(xì)胞或大細(xì)胞碎片。然后收集上清液并轉(zhuǎn)移至超速離心管（Polyallomer Quick-Seal centrifuge tubes 25×89 mm, Beckman Coulter）。使用超速離心機(jī)（Optima L-90 K or Optima XE- 90 Ultracentrifuge, Beckman Coulter）以16,500×g（Type Ti 45, Beckman Coulter）離心20分鐘，以除去微泡。小心地收集上清液并用Type 45 Ti轉(zhuǎn)子在4℃以120,000×g離心5小時。將外泌體沉淀用PBS溶解并儲存在-80℃。對于RNA測序和蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)，匯集從四個不同MSC批次制備的外泌體，以減少批次間差異的潛在影響。

MSC外泌體介導(dǎo)的EAE恢復(fù)機(jī)制模式圖

參考文獻(xiàn)：

Riazifar M, Mohammadi MR, Pone EJ, Yeri A, Lässer C, Segaliny AI, McIntyre LL, Shelke GV, Hutchins E, Hamamoto A, Calle EN, Crescitelli R, Liao W, Pham V, Yin Y, Jayaraman J, Lakey JRT, Walsh CM, Van Keuren-Jensen K, Lotvall J, Zhao W. Stem Cell-Derived Exosomes as Nanotherapeutics for Autoimmune and Neurodegenerative Disorders. ACS Nano. 2019 May 29. doi: 10.1021/acsnano.9b01004. [Epub ahead of print]

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